分光光度法是指应用分光光度计的分析方法，具有灵敏、准确、快速及选择性好等特点。

通常所测样品溶液浓度下限可达10

-6

～10

-5

mol/L，适用于测定食品中的微量组分（如肉制品中的亚硫酸盐、糖果中的二氧化硫等）。

一、原理

1.1 物质对光的选择性吸收

当光束照射到物质上时，光与物质发生相互作用，产生反射、散射、吸收或透射。

若被照射的是均匀溶液，光的散射可以忽略。

1.1.1 溶液颜色的产生

当一束白光通过某一有色溶液时，一些波长的光被溶液吸收，另一些波长的光则透过溶液。透射光或反射光刺激人眼使人感到颜色的存在。人把自身能感觉到的光定义为可见光。

在可见光区，不同波长的光呈现不同的颜色，因此溶液的颜色由透射光的波长所决定。

透射光与吸收光可组成白光，故称这两种光互为补色光，两种颜色互为补色。

1.1.2 光吸收的本质

当一束光照射到某物质或其溶液时，组成该物质的分子、原子或离子与光子发生“碰撞”，光子的能量就转移到分子、原子或离子上，是这些粒子由最低能态（基态）跃迁到较高能太（激发态），这个作用称为物质对光的吸收。被激发的粒子约在10

-8

s后回到基态，并以热或荧光等形式释放出能量。分子、原子或离子具有不连续的量子化能级，仅当照射光光子的能量hυ，与被照射物质粒子的基态和激发态能量之差相当时，才能发生吸收。

不同物质微粒由于结构不同而具有不同的量子化能级，其基态和激发态能量差也不相同。

所以物质对光的吸收具有选择性。

1.1.3 吸收曲线

吸收曲线，也称为吸收光谱，描述了物质对不同波长的光的吸收能力。将不同波长的光透过某一固定浓度和厚度的有色溶液，测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度（即吸光度），然后以波长为横坐标，以吸光度为纵坐标作图，绘制的曲线即为吸收曲线。

不同浓度的同一物质，在吸收峰附近的吸光度随着浓度增加而增大，但最大吸收波长不变。若在最大吸收波长处测定吸光度，则灵敏度最高。因此，吸收曲线是分光光度法中选择测定波长的重要依据。

1.2 光吸收基本定律

即朗伯-比尔定律：

当一束平行单色光通过液层厚度为b的有色溶液时，溶质吸收了光能，光的强度就要减弱。

溶液的浓度越大，通过的液层厚度越大，入射光越强，则光被吸收的越多，光强度的减弱也越显著。

该定律是紫外可见分光光度法等各类吸光光度法定量分析的依据，是由实验观察得到的，不仅适用于溶液，也适用于其他均匀非散射的吸光物质。

A=lg(I/I

0

)=εbc

A-吸光度；

I

0

-入射光强度，cd；

I-透射光强度，cd；

ε-吸光系数，L/(mol�Bcm)；

b-液层厚度（光程长度），cm；

c-有色溶液的浓度，mol/L。

其物理意义为：当一束平行单色光通过单一均匀、非散射的吸光物质溶液时，溶液的吸光度与溶液浓度和液层厚度的乘积成正比。

式中ε是吸光物质在特定波长和溶剂的情况下的一个特征常数，数值上等于浓度为1mol/L的吸光物质在1cm光程中的吸光度。

ε是吸光物质吸光能力的量度，ε值越大，方法的灵敏度越高。

由实验结果计算ε时，常以被测物质的总浓度代替吸光物质的浓度，实际上时表观摩尔吸光系数。

在多组分体系中，如果各种吸光物质之间没有相互作用，体系的总吸光度等于各组分吸光度之和，即吸光度具有加和性。

透光度T是透射光强度I与入射光强度I

0

之比，即：

T=I/I

0

因此：A=lg(1/T)

二、主要部件

尽管光度计种类型号繁多，但它们都是由相同的基本部件组成的，包括光源、单色器、吸收池和检测系统。

2.1 光源

在测量吸光度时，要求光源发出所需波长范围内的连续光谱，要具有足够的光强度，并在一定时间内能保持稳定。在可见光区测量时，通常使用钨丝灯作为光源。钨丝加热到白炽状态时会发出波长在320~2500nm之间的连续光谱。

钨丝灯工作温度一般为2600～2870K，熔点为3680K。钨丝灯的温度决定于电源电压，电源电压的微小波动会引起钨灯光强度的很大变化，因此必须使用稳压电源。

在紫外区测量时，常采用氢灯或氘灯产生波长在180～375nm之间的连续光谱作为光源。

其理想光源应具有覆盖整个紫外可见光区的连续辐射，强度应比较高，且随波长变化能量变化不大，但在实际上难以实现。

氘灯辐射强度比氢灯高2~3倍，寿命也比较长。氙灯的强度一般高于氢灯，但欠稳定，波长范围180～1000nm，常用作荧光分光光度计....