Western Blot(简称WB)，蛋白质免疫印迹法，是基于蛋白质SDS-PAGE电泳分离和特异性抗体识别蛋白的特性，通过显色技术，以达到检测目的蛋白的技术。该技术广泛应用于定性检测蛋白水平的表达，活性分析与鉴定。该实验步骤多，关键点多，耗时长，每个步骤可能都影响最终的结果，所以实验中经常出现各种问题。本文对WB实验中常出现的各种问题进行归纳总结，并给出相应的解决方法，以便了解WB实验中的注意点和规范操作的必要性，同时对WB出现的问题分析和解决提供参考。

1、无信号，没有阳性条带

WB结果中常出现白板或者条带无信号响应现象，如图1。我们针对出现该现象可能的原因主要从抗体，抗原，实验操作和缓冲液几方面进行分析。

图1 没有阳性条带案例

抗体相关原因

WB中所用到抗体包括一抗和二抗，在该问题上，两个抗体方面可能存在的原因以及相对应的解决方法，归纳总结在表1。

表1 抗体相关原因

可能原因

解决办法

二抗选用不恰当

选择与一抗相匹配的二抗类型，二抗需和一抗宿主的物种相同

无足够量抗体结合目标蛋白

降低一抗稀释度；使用效价高的一抗；延长抗体孵育时间；

膜充分浸润在液体中。

储存时间较长或储存条件不当导致抗体失活

选择在有效期内的抗体；工作液现配现用

抗原相关原因

抗原即所需要检测目的蛋白，其相关原因可能是未被一抗识别或者是抗原量不足引起，相对应解决办法见表2。

表2 抗原相关原因

可能原因

解决办法

一抗不识别待检测的目的蛋白

参照数据库对比抗原序列和蛋白序列，选择合适一抗，确保会发生特异性反应

抗原量不足或降解

每条泳道上样量不低于 20-30 ug, 使用蛋白酶抑制剂并设置阳性对照

实验操作相关原因

实验操作规范对于实验结果也至关重要，且需要重复摸索。无条带出现可能是目标蛋白未从胶转移至膜上或者洗膜过度，具体分析见表3。

表3 实验操作相关原因

可能原因

解决办法

转膜不充分

使用丽春红染膜或使用考马斯亮蓝染胶检测转膜效果；检查转膜操作是否正确；

优化电转条件；使用小孔径膜，防止转膜过度

洗膜次数过多

减少洗膜次数，洗膜时间和温度

缓冲液相关原因

实验中用到多种缓冲液，缓冲液的选择和保存，以及选择合适的显色方式都很重要。无目标蛋白出现可能与缓冲液有关的原因和解决方法见表4。

表4  缓冲液相关原因

可能原因

解决办法

封闭液与一抗或二抗有交叉反应

使用温和的去污剂如吐温，或更换封闭液

缓冲液中含有HRP抑制剂

避免叠氮化钠和HRP一起使用

ECL发光液失活

更换新的有效的发光液

显色方式选择

延长曝光和显色时间；ECL显色比DAB显色灵敏度高5-10倍。

2、有阳性条带，但条带信号弱

WB结果中可能出现有目标蛋白条带，但是目标条带在膜上颜色较浅，如图2。该现象原因与 1(无信号，没有阳性条带)中无目标条带较为相似，可能导致该现象的原因我们也从4个方面进行分析，并给出相应的解决方法，具体分析见表5。

图2 ....